HPLC يعني كروماتوگرافي مايع با فشار زياد يا كروماتوگرافی مايع با كاركرد عالي است.
HPLC از دو فاز ثابت و متحرك تشكيل شده است. كه فاز ثابت جامد و فاز متحرك مايع است.
اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه HPLC
1- مخازن محلول :
كه در آنها فاز متحرك و يا محلول هاي شستشو دهنده ستون ريخته شده است.
2- موتور يا پمپ:
چون ستونها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم است. به اين جهت قابليت نفوذ كم مي شود و براي اين كه محلول جريان داشته باشد بايد فشار وجود داشته باشد. براي ايجاد فشار از پمپ ها استفاده مي كنيم. پمپ فشاري حدود psi 4500 مي تواند ايجاد كند و بايد فشار آن ثابت باشد.
محلول توسط پمپ با جریان ثابتي بر روي فاز ثابت حركت داده مي شود. حداكثر جریانی كه فاز متحرك مي تواند داشته باشد ۲،۵میلی لیتر در یک دقیقه است. و نظر به نوع كاري كه مي خواهيم انجام دهيم فلو یا جریان فرق مي كند. هر چه جریان كمتر باشد، فاصله پيك ها بيشتر است.
ميزان فشار بستگي به جریان دارد وقتي جریان ml/min 0.8 است ميزان فشار حدود psi 1500 مي شود. ميزان فشار بستگي به نوع ستون دارد حداكثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداكثر تغييرات فشار Psi 100 است. حداكثر فلوريت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، محلول را از مخزن مي گيرد و با سرعت معین آن را بداخل دستگاه وارد مي كند.
به دو روش مي توانيم كار كنيم:
الف: روش ايزوكراتيك isocratic
اگر نسبت هاي مختلفی از فاز متحرك را در يك مخزن بريزيم و از همان مخزن فاز متحرك را برداشت كنيم از روش ايزوكراتيك استفاده كرده ايم.
ب: روش گراديانت gradient :
اجزاء فاز متحرك در مخازن مختلف قرار دارند. دستگاه قابليت اين را دارد كه خودش نسبت هاي مختلف را از مخازن برداشت كند، مثلا می خواهيم ازمخزن اول ۸۰ میلی لیتر از مخزن دوم ۸ میلی لیتر و از مخزن سوم ۱۲ میلی لیتر بكشد و بعد نسبت ها را مخلوط مي كند. از اين روش وقتي استفاده مي كنيم كه نسبت هاي موردنظر را نمی دانيم و بخواهيم روش کارپيدا كنيم. ولي وقتي درصد فاز متحرك براي ما روشن شد مي توانيم از روش ايزوكراتيك استفاده كنيم. فاز متحرك با جریان ثابتي بر روي ستون حركت داده مي شود.
حداكثر فلو یا جریان در این تجربه ml/min0.8 يا 1 است. بعد از فعال كردن هر پمپ flow rate را از كم به زياد كم كم بالا مي بريم تا حدود ml/min 0.8 يا 1 و مي گذاريم حدود پانزده دقیقه يا نيم ساعت با فلوريت بالا كار كند و بعد فلوريت را به تدريج پايين مي آوريم تا صفر و بعد پمپ را عوض مي كنيم. يا دستگاه را خاموش مي كنيم، فلوريت كه بالا برود فشار هم بالا مي رود. بعد از اتمام كار ستون را با محلول هاي شستشو دهنده مي شوئيم. محلول هاي شستشو را در مخازن ريخته و پمپ ها را به ترتيب فعال مي كنيم اول دستگاه را با آب و متانول شسته و سپس با متانول خالص مي شوئيم. هر پمپ را كه فعال كرديم بايد ابتدا هوا گیری کنیم.
3- انجکتور injector:
از سوزن های مختلف با ظرفيت هاي مختلف استفاده مي كنيم. حجم تزريق ۳- ميكروليتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتي بنام گارد كالوم يا پري كالوم مي شود كه محافظ ستون است، طول كاردكالوم حدو يك سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پركننده آن از جنس ماده پركننده ستون است. اگر ماده مورد تشخیص ناخالصي داشته باشد يا با ماده داخل ستون برهم کنشی ايجاد كند درگاردكالوم انجام مي شود و به ستون آسيبي نمي رسد.
4- ستون:
طول ستونهاي دستگاه حدود 30-10 سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترين ستون C18 ، ODS آکتا دسيل سيلان است، ستونها را پس از اتمام كار بايد با محلولهاي شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده كرديم ستون را با آب و متانول و بعد با متانول خالص شستشو مي دهيم.
فاز ثابت بصورت ذرات ريزي در داخل ستون قرار گرفته است كه بر اثر چسبيدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرك جداسازي انجام مي شود. نمونه ابتدا وارد گاردكالوم و بعد وارد ستون مي شود. ODS اكتا دسيل سيلان گروههاي الكيل غيرقطبي زيادي دارد، فاز متحركي كه استفاده مي كنيم اکثرا قطبي است. فاز متحرك و ماده پركننده ستون از نظر قطبيت بايد عكس هم باشند.
در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معكوس هست. اگر فاز ثابت قطبي و فاز متحرك غيرقطبي باشد سيستم را فاز نرمال و در صورتي كه ستون غيرقطبي و محلول قطبي باشد دراین صورت سيستم را فاز معكوس مي گويند. مشتقات آلكيل سيلان و فنيل سيلان ايجاد ستونهاي غير قطبي مي كنند و معمولا ستون غير قطبي و فاز متحرك قطبي است بنابراين از فاز معكوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ يا Stainless steel است.
5- دتکتور ها:
دتکتور ها بايد حساس باشند و اثر مخرب بر روي اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسيعي براي غلظت بايد خطي باشد.
انواع دتکتور ها:
(a)- مهمترين آنها دتکتور ماورا بنفش است که براي اجسامي كه در ناحيه UV-VIS جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد. در اين دتكتور جذب انجام مي شود و باعث كاسته شدن انرژي مي شود كه اين كاسته شدن قابل اندازه گيري است. ميزان كاسته شدن انرژي متناسب است با غلظت، بايد طول موج را مشخص كنيم كه در اينجاnm λ=225 است. محلول نبايد در طول موج انتخابي جذب داشته باشد..
(b)- دتکتور ضريب شكست، اين دتکتور خيلي حساس به حرارت است. از تغييرات يا تفاوتي كه بين ضريب شكست سيستم محلول به تنهايي و سيستم محلول همراه نمونه ايجاد مي شود استفاده مي كنيم.
(c)- دتكتور فلورسانس حساس تر از UV است ولي كم استفاده مي باشد چون موادي كه خاصيت فلورسانس داشته باشند كم هستند.
(d)- دتکتور الكتروشيميايي كه عملکرد آن بر مبنای واکنشهای اکسید و احیا می باشد.
6- ثبت کننده :
در اثر حركات قلم پيك هائي رسم مي شود كه به مجموعه آنها كروماتوگرام مي گويند. به طريق كيفي پيك ها را براساس زمان اقامت يا نگهداري يا Retention time مي شناسند. زمان اقامت فاصله زماني از لحظه تزريق تا رسيدن به نقطه اوج يك پيك است. براي محاسبه كمي سطح هر نوار جذبي را حساب مي كنيم، سطح هر نوار جذبي متناسب با مقدار جسم است كه بوسيله انتگراتور يا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست مي آيد سطح هر نوار جذبي يعني حاصلضرب قاعده و نصف ارتفاع است. روش بريدن نوار و وزن كردن آنها روش قديمي است ولي امروزه توسط سطح سنج يا انتگراتور بدست مي آيد خود دستگاه AUC را مشخص مي كند. مي توان از ارتفاع هم استفاده كرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص كنيم AUC و ارتفاع با يك دستور ساده قابل تبديل بهم هستند.
طریقه عمل ستون HPLC
کار این ستون نیز به اندازه ذرات داخل ستون بستگی دارد. هرچه اندازه ذرات کوچکتر باشد، کیفیت HPLC بیشتر میشود.
فاز ساکن و فاز متحرک:
در مورد فازهای ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد و آن ، این است که باید خاصیت قطبی بودن حلشونده و فاز متحرک ، نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروههای عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:
هیدروکربن< اترها < استرها < کتنها < آلدهیدها < آمیدها < آمینها < الکلها
به عنوان مثال ، فاز ساکن با قطبیت بالا مثل سیلیکات یا آلومین یا مایعات قطبی مثل تریاتیلن گلیگول که روی ذرات سیلیکات قرار گرفتهاند و فاز متحرک ، محلول نسبتا غیر قطبی مثل هگزان یا ایزو پروپیل اتر را میتوان نام برد.
خصوصیات فاز متحرک ( HPLC )
خالص بودن
نقطه جوش حدود 20 تا 50 بالاتر از درجه حرارت ستون
چسبناکی کم
تعامل پذیری کم
قابلیت تطابق با آشکارساز
سمیت و اشتعال پذیری کم
مزایای HPLC
کاربرد HPLC برای مواد غیر فرار به قرار زیر میباشد:
از ستونهای طولانی که سرعت محلول در تمام طول آنها نزدیک به مطلوبترین سرعت باشد، میتوان استفاده کرد و امکان تغییر دادن ماهیت فاز متحرک برای انجام شستشوی تدریجی و شستشوی مرحلهای یا هر دو وجود دارد.
آشکارساز
آشکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع - مایع تمام خصوصیات آشکارسازهای کروماتوگرافی گازی را دارند، بجز اینکه در آشکارساز کروماتوگرافی مایع نیازی به محدوده حرارت بالا نیست. این شناساگرها کلا دو دستهاند:
یک نوع کلی که به فاز متحرک عکسالعمل نشان میدهند.
نوع خاصی که به حل شونده حساس هستند.
